【 – 字数作文】
我被克隆了350(一)
电路的故事301：吴聪庆与其他中国工程师一样，一直担负着默默耕耘的角色。吴聪庆是台湾台南县人，台大电机系1973毕业。1975年来美国。在纽约州立大学石溪分校念完电机硕士，又赴宾州大学（University of Penn.）取得电机博士学位。1980年他毕业后到Signet-ics 公司工作，这工作牛啊。
电路的故事302：Signetics由一群从仙童出来的工程师创办，自然公司延续了创新的火种，这个公司的创始人说服了雷曼兄弟，投资100万美元创办了公司，他们最牛的产品是555定时器，相信大家都用过的，不过，吴聪庆加入到时候，这个公司已经被飞利浦公司（现在的@NXP恩智浦半导体 ）收购。
电路的故事303：在Signetics工作两年后，吴聪庆加盟了一个专做EPROM 和EEPROM的新创公司Seeq Technology ，在这里他认识了Gust Perlogos 和George Perlogos兄弟俩，George 是Seeq 创办人之一担任的工程部副总裁。Gust原在Intel 工作，来到Seeq 后负责设计作，而吴聪庆则负责新科技开发。
电路的故事304：两年后，也就是1984年Seeq 的7个创始人开始了内讧，董事会把总裁Gordy Campbell（也是C＆T 创办人）赶走了，而George 因为支持 Gordy也被赶跑了，许多人都离开了包括吴聪庆和Gust。 他们仨儿聚在一起就想我们还是创业吧，于是凑了二万元租了个办公室，Atmel就这样创立了。
电路的故事305：公司成立后，吴聪庆带着企划书到处与专业投资人交谈，结果没有人肯投资，倒是通用仪器公司（Ceneral Instrument）希望雇用他们，不过他们仨儿不答应，于是通用仪器与他们签了一个共同开发产品的合约，由他们三人提供技术，而由通用仪器公司提供资金和工厂，这简直太好了！
电路的故事306：这个通用仪器提供的工厂位于凤凰城，后来独立出来变成了@Microchip微芯 公司，看来Atmel和Microchip还有点渊源呢，1985年2月ATMEL 公司正式开张了，由George 担任公司的总裁和CEO，Gust 负责设计和记忆体部门，吴聪庆负责所有技术和工厂，并成功推出了四五款新品。
电路的故事307：通用仪器后来与韩国“现代”公司（Hyundai）签约，把EPROM拿去韩国生产。于是吴聪庆带着团队来到韩国把工厂运转起来，1986年，吴聪庆等转与日本三洋（Sanyo）合作。三洋有个厂是全新的有机器但没产品，atmel团队把制造流程开发出来，之后三年ATMEL 的芯片都由这个厂生产。
电路的故事308：凭借这样的模式，ATMEL 慢慢成长起来，它体会到拥有自己代工厂的可贵，于是在88年和89年买了Honeywell公司的厂，再由吴聪庆带队将设备装入，改造为ATMEL 的foundry。93年又投资了一个新厂，这些代工厂成为Atmel的主力，凭借这样稳妥的发展策略，Atmel从成立起就盈利了。
电路的故事309：ATMEL起初的产品主要是存储类产品，主要是EPROM、EEPROM和Flash Memory。其特点是低功耗。在很低压的情况下也可以工作，做存储产品，ATMEL 的优势通过量控制成本，这得益于吴聪庆的判断。他发现在科州生产的成本低，在市场上颇能占优势。当然，现在这个优势转移中国了。
我被克隆了350(二)
目录
生产部克隆组操作流程 ……………………………………………………………….. 2
一、PCR扩增目的片段 …………………………………………………………… 2
二、PCR产物的纯化（或者切胶纯化） …………………………………… 4
三、DNA片段的酶切及纯化 ……………………………………………………. 7
四、质粒的提取及酶切 ………………………………………………………….. 8
五、连接反应 ……………………………………………………………………… 10
六、感受态细胞的制备 ………………………………………………………… 12
六、转化 …………………………………………………………………………….. 13
七、挑取单克隆 ………………………………………………………………….. 15
八、菌液PCR验证 ……………………………………………………………….. 16
九、测序 …………………………………………………………………………….. 18
十、转交 …………………………………………………………………………….. 18
附：克隆组常用试剂配方 ………………………………………………………….. 18
生产部克隆组操作流程
一、PCR扩增目的片段
实验原理:PCR(polymerase chain reaction)是一种常用的分子生物学技术，常用于体外扩增特异的DNA片段。基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性–退火–延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链（有时直接用单链DNA作为模板），以便它与引物结合；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板–引物结合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性–退火–延伸三个基本过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。
1、实验仪器及试剂
1.1实验仪器：PCR仪： LongGene L96+ Thermal cycler
离心机：TGL-16, 湘仪
凝胶电泳仪：Tanon EPS 300
凝胶成像系统：Tanon 2500，
其林贝尔离心机：LX-5000
微波炉
1.2实验试剂：天根pfu DNA polymerase(2.5U/ul)
天根dNTP（10mM/ul)
TAKARA DNA marker（DL5000、DL10000）
1XTBE缓冲液
超纯水
2、实验步骤：
(1)将干粉引物以12000rpm离心30s，小心打开管盖按照引物订单报告加灭菌的超纯水稀释至10mM，震荡混匀（打开盖子前一定要离心，避免干粉引物飞溅）。
（2）在0.2ml的离心管中加入以下成分：
（模板一般可以是质粒、单或双链DNA片段、cDNA等或其他不同
复杂类型的模版，加入的量有一定的变化。一个典型的50ulPCR反应，加入的模板量为0.1ug-2ug；dNTP的浓度为50umol/L-200umol/L；每条引物的量为0.1umol-1umol，加入的酶为1.5U-2.5U。最后加水保证总体积为50ul，做多管的时候可以把除引物模板以外的组分混合后分装，离心5s混匀，然后置于PCR仪的工作台上）。
（3）设置PCR运行参数并运行：
（4）用微波炉加热0.75%琼脂糖凝胶至完全溶解，在胶板上插上梳子倒一块胶，静置凝固。
（5）PCR反应结束后取2ul产物进行电泳，检验是否扩增成功，确定有目的条带后其余样品进行PCR产物纯化（或胶回收）。
二、PCR产物的纯化（或者切胶纯化）
实验原理：PCR产物一般都含有过量的引物、DNA聚合酶、引物二聚体、模板DNA及dNTP等，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切反应、双脱氧PCR测序反应等过程，因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多，商用化试剂盒的出现使得DNA
的纯化过程变
得更加简便快捷。本实验采用Biospin胶回收试剂盒对PCR产物直接进行纯化，Extraction Buffer促进60bp-23kb间的DNA片段选择性的吸附在膜上，经Wash Buffer洗涤除去引物二聚体、酶蛋白、单核苷酸、荧光染料等，最后经去离子水将目的DNA片段从膜上洗脱下来。
1、实验仪器及试剂
1.1实验仪器：湖南湘仪离心机：TGL-16,
金属恒温加热器：博彩生物 HB301
1.2实验试剂：Biospin胶回收试剂盒
超纯水
2、直接纯化实验步骤：
（1）向PCR产物中加入5倍体积的Extraction Buffer,混匀。
（2）将混合液全部转移到吸附柱，静置2分钟，8000rpm离心1min,弃去收集管中的液体（静置是为了保证吸附膜能充分吸附DNA）。
（3）向吸附柱中加入500ul Extraction Buffer，12000rpm离心1min,弃去收集管中的液体(洗去残留在吸附膜上的酶蛋白物质)。
（4）向吸附柱中加入750ul Wash Buffer（初次使用时按照说明书加入相应体积的无水乙醇），静置5min，12000rpm离心1min，弃去收集管中的液体（洗去吸附在膜上的离子盐类等物质）。
（5）12000rpm空离2min（离心除去吸附在膜上的乙醇，避免对后续实验的影响）。
（5）将吸附柱转移到灭菌的1.5ml的离心管中，静置1min（静置使乙醇完全挥发）。
我被克隆了350(三)
第三章 分子克隆载体（Molecular cloning vectors）
一、名词解析
1. 质粒：质粒是染色体外的遗传因子，能进行自我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋白质）；大多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分子（covalently closed circle , cccDNA），少数为线性；大小一般为1～200Kb，有的更大。
2. 质粒拷贝数：质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单一质粒的份数同染色体数之比值,常用质粒数/每染色体来表示。不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。
3. 质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。
4. 质粒的转移性：质粒具转移性。它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。
5. 穿梭质粒：既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。这类载体必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点，又含有真核生物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。它用来转化细菌，又可以用于转化真核细胞。
6. α-互补：α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的 β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷 β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的
7. 温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体。
8. 溶源性细菌：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。
9. 整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染色体DNA中，便叫做已整合的噬菌体DNA。这中细菌提DNA组入细菌染色体DNA的过程，叫做噬菌体DNA的整合或插入。
10. 溶源化：用温和的噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程叫做溶源化。
11. 载体:将外源 DNA 或基因携带入宿主细胞（host cell）的工具称为载体，
载体是基因操作的核心工具。
12. 粘粒: 粘粒（cosmid）实际是质粒的衍生物，是带有 cos 序列的质粒。cos
序列是 l 噬菌体 DNA 中将 DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。粘粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（ampr）， cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段 DNA ，克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。
13. 柯斯质粒: 一种由质粒和A噬菌体cos尾巴构建的复合载体。柯斯质粒载体
又叫粘粒载体，这是一种由人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。柯斯质粒在结构组成上具有l噬菌体的特性、也具有质粒载体的特性和高容量的克隆能力，一般可插入35～40kb的外源基因。
14. pcos1 EMBL载体: pcos1 EMBL 是设计用于筛选体内重组的重组粘粒文库，
通过同源重组过程达到筛选目标克隆的目的。该载体的复制起点来源于 R6K 质粒，与 ColE1 复制起点无同源性，属于不同的不相容群，含卡那霉素和四环素抗性基因。
15. F 因子: 大肠杆菌的 F 因子是一个约 100kb 的质粒。它编码60多种参与
复制、分配和接合过程的蛋白质（Willetts and Skurray，1987）。虽然F因子通常以双链闭环DNA（1-2个拷贝/细胞）的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处进行随机整合（Low，1987）。
16. 穿梭载体: 穿梭载体（Shuttle vector）是能够在两类不同宿主中复制、增
殖和选择的载体。
17. 整合载体: 在生物学研究和基因工程应用中，会涉及将某个基因或某些基因
插入到染色体中去的工作，承担这部分工作的载体，可称为整合载体。
18. 酵母人工染色体: 酵母人工染色体 YAC 人工染色体载体是利用酿酒酵母
（Saccharomyces cerevisiae）的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。
19. 端粒重复序列: 端粒重复序列定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的
DNA 不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。
20. 细菌人工染色体：细菌人工染色体是基于大肠杆菌的 F 质粒构建的，高通
量低拷贝的质粒载体。
21. 标签蛋白：用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽 （Tag），常用
的有谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transferase, GST） 、六聚组氨酸肽（polyHis-6） 、蛋白质 A（protein A）和纤维素结合位点（cellulose binding domain）等。
22. 随机突变体库：随机突变体库是指标记基因在载体的携带下通过 DNA 重组
事件随机插入基因组中而形成的突变体的集合。
23. 琥珀突变：在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，
则这种突变称为琥珀突变。
24. 克隆载体：用于扩增或保存 DNA 片段的载体称为克隆载体。
25. 插入失活：指当外源 DNA 片段插入某一基因后，导致该基因失活。
26. 染色体步查：采用一段分离自某一重组体一端的非重复 DNA 片段作为探针
以鉴定含有相邻序列的重组克隆。
27. 表达载体：该类载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的，主要增添了强
启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。
二、填空题
1. 质粒DNA、病毒DNA、质粒和病毒DNA杂合体
2. 复制区（含有复制起点）、选择标记（主要是抗性基因）、克隆位点（便于外
源DNA的插入）
3. 同一个不亲和、复制机制相同
4. pMB1、pSC101、pSF2124
5. pBR322 、M13、pMB1、转座子
6. DNA连接酶
7. 溶源性
8. β-半乳糖苷酶
9. 感染复数和营养状态
10. attP attB
11. ga1 基因 bio 基因
12. 感染复数和细胞的营养状态
13. 插入型载体、置换型载体
14. 质粒复制起点（colE1）,抗性标记（ampr）,cos 位点
15. 质粒,A噬菌体
16. R6K ，卡那霉素四环素
17. 着丝粒(cen4)、自主复制序列(ARS1)、来自四膜虫的端粒(Tel)
18. 红色菌落，白色菌落
19. 不稳定的
20. F质粒
21. 低拷贝性
22. 定点整合
23. 自主复制序列，端粒
24. 融合蛋白
25. PYAC4
26. 大片段DNA文库
27. EcoRⅠ，SmaⅠ
28. 缺失，基因重排，嵌合体
29. 游离状态 ，整合状态
30. 重组子，空载体
31. 克隆载体
32. 谷胱甘肽转移酶基因, 凝血蛋白酶
33. 融合蛋白、非融合蛋白
34. 复制子
35. 选择标记、筛选标记
36. 氨苄青霉素、四环素
37. 强启动子
38. 多功能载体
39. 不相容性
40. 严谨型、松驰型
41. 外源基因、增加、表达元件
42. 溶源状态、裂解循环
43. cos 序列、质粒、λ 噬菌体
44. 强启动子
45. 裂解循环、溶源状态
46. cos 序列
三、选择题
1. A
2. B
3. D
4. B
5. E
6. A
7. B
8. B
9. D
10. D
11. B
12. C